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环糊精助力纳米银伤口敷料的绿色合成

2021-03-01 admin 29

 
 
  由于高微生物负荷和微生物耐药性的问题,慢性伤口往往难以治疗。近年来,纳米银在伤口处理中的应用引起了人们的关注。但纳米银的合成方法大多使用有机溶剂和有毒还原剂,对环境有潜在威胁,对哺乳动物细胞系有细胞毒性作用。如何进行纳米银颗粒的绿色合成成为热点话题。

  姜黄素(CUR)是一种天然的多酚类化合物,具有抗菌、抗氧化和抗炎作用,可作为还原剂和封盖剂用于纳米银的绿色合成。姜黄素通过环糊精微胶囊化来克服其疏水性,利用姜黄素-羟丙基-β-环糊精复合物(CUR:HPβCD)制备纳米银颗粒(cAgNP),并将其加载到细菌纤维素(BC)水凝胶中,保持伤口处湿润以提高伤口愈合性能。除了具有较高的细胞相容性外,这种新型敷料还对三种常见的伤口感染病原菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和金黄色念珠菌)具有抗菌活性。




高分子材料制备方法

CUR:HPβCD英亚体育app官方下载物的制备

  采用溶剂蒸发法制备CUR:HPβCD英亚体育app官方下载物。在室温下,将姜黄素丙酮溶液滴入HPβCD水溶液中,不断搅拌,使丙酮缓慢完全蒸发。离心,过滤并冻干。

cAgNP的制备

  通过CUR:HPβCD英亚体育app官方下载物还原硝酸银,建立绿色化学合成cAgNP方法。在沸腾条件下向CUR:HPβCD水溶液中边搅拌边滴入1 mM 硝酸银溶液。将混合溶液煮沸3小时还原银离子,然后在室温下冷却30分钟。在整个还原过程中,烧瓶上覆盖铝箔,保持黑暗状态,避免发生光化学反应。

负载cAgNP的BC水凝胶的制备

  选择木霉生产BC,在静态条件下,在灭菌的HS培养基中生物合成水凝胶。在实验使用前对BC膜进行纯化。纯化后的BC膜在消毒滤纸上去除多余水分,然后在4℃无菌搅拌条件下使用cAgNP水溶液浸泡水凝胶以实现装载。

cAgNP表征

  使用TEM及DLS对纳米粒子的粒度分布进行表征。

  TEM成像显示,纳米颗粒形貌以球形为主,边缘光滑,大部分粒径范围为20 ~ 55 nm(80%),平均粒径为42.71±17.97 nm。纳米颗粒被一层薄薄的覆盖材料均匀地包裹着。DLS测量结果表明,纳米颗粒的水动力学粒径范围为182.10±8.83 nm,多分散性指数(PDI)值为0.196±0.009。纳米粒子的成核形成和聚集可以是连续发生的。



图1. 采用CUR:HPβCD制备的cAgNP的表征

负载cAgNP的BC水凝胶表征

  使用SEM对负载cAgNP的BC水凝胶进行表征。

  BC具有纤维网络结构,纯化前木霉细胞被困在网络结构中,纯化后木霉细胞被成功去除。BC纤维网络中存在的空隙允许治疗剂浸渍进入,冻干的载有cAgNP的BC的SEM显示,cAgNP穿过了空隙,并被物理地困在了纤维网络结构中。另外,除 cAgNP外,BC中还捕获了游离的CUR:HPβCD,由于姜黄素的存在,这可能更有利于伤口的愈合。纳米颗粒的形貌和尺寸也在SEM显微照片中确定,其平均直径在37.2-65.1 nm之间,并且大多数纳米颗粒呈球形,这些结果与TEM结果一致。



图2. (a)纯化前的BC水凝胶,木霉细胞突出表示;(b)纯化后的BC水凝胶;(c,d)在BC纤维网络中加载cAgNP

负载cAgNP的BC水凝胶的细胞相容性

  使用三种不同的哺乳动物细胞系评估了负载cAgNP的BC水凝胶的细胞相容性。

  MTT法检测的细胞毒性显示,负载cAgNP的BC水凝胶具有细胞相容性,所有检测的细胞系均表现出良好的存活率。对比游离cAgNP与负载cAgNP的BC水凝胶在U251、MSTO和Panc 1细胞株上的细胞相容性。结果表明,游离cAgNP对所有被检测的细胞株均有细胞毒性,导致其细胞存活率低于负载cAgNP的BC水凝胶组的细胞株(p < 0.001)。

  这些结果表明,BC能够控制cAgNP的释放,从而使其对哺乳动物细胞的细胞毒性作用最小化。



图3. 细胞相容性测定结果
 
(a)负载cAgNP的BC水凝胶和等量游离cAgNP处理24小时后的细胞活力(%)(n = 8);(b) 负载cAgNP的BC水凝胶和等量游离cAgNP处理24小时后的细胞代表性照片(10倍放大)


负载cAgNP的BC水凝胶的抗菌效果

  采用圆盘扩散法检测24小时后负载PBS的 BC水凝胶、负载HPβCD的BC水凝胶和负载cAgNP的BC水凝胶对P. aeruginosa、S. aureus和C. auris的抗菌效果。

  负载PBS的 BC水凝胶与负载HPβCD的BC水凝胶没有显示抗菌活性,而负载cAgNP的BC水凝胶对所有三种测试微生物菌株都表现出显著的抗菌活性(p < 0.001)。这些结果证实了负载cAgNP的BC水凝胶的广谱抗菌活性。此外,与金黄色葡萄球菌相比,负载cAgNP的BC水凝胶对p . aeruginosa具有更强的抗菌活性 (p < 0.001)。这可能是因为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞结构不同。据报道,AgNPs具有从细菌细胞壁分离细胞质的能力(即胞浆溶解作用),从而导致P. aeruginosa细胞死亡。而在在金黄色葡萄球菌中,AgNPs主要通过抑制细胞壁的合成而导致细菌细胞死亡。



图4. 24 h圆盘扩散测试结果

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